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練習(xí)1：查找CRISPR位點(diǎn)

在本練習(xí)中，您將運(yùn)行Find CRISPR位點(diǎn)功能來查找LYP1 CDS序列上的“GN（20）GG”CRISPR網(wǎng)站。

選擇LYP1 CDS（這個(gè)文件是geneious專用的demo數(shù)據(jù)格式，當(dāng)您下載了geneious可以導(dǎo)入進(jìn)去使用，或者導(dǎo)入您感興趣領(lǐng)域的數(shù)據(jù)）文檔，然后轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點(diǎn)。

首先，將選項(xiàng)重置為默認(rèn)設(shè)置。要做到這一點(diǎn)，點(diǎn)擊窗口左下角的齒輪，并選擇重置為默認(rèn)值（如果當(dāng)前設(shè)置為默認(rèn)設(shè)置，這將變?yōu)榛疑?/font>

由于我們想要在此序列中的任意位置查找CRISPR位點(diǎn)，因此在綁定位點(diǎn)旁依次選擇無處不在。

在Motif面板中，使用Target和PAM字段指定要搜索的gRNA序列。如果您希望評估所有潛在的CRISPR位點(diǎn)，請?jiān)谀繕?biāo)框中輸入N（20）。或者，如果您想要檢查異地綁定的特定序列，則可以在目標(biāo)框中輸入確切的序列。在本教程中，我們對“GN（20）GG”指南序列感興趣。目標(biāo)序列為GN（19），PAM序列為NGG，因此目標(biāo)字段類型為“GN（19）”，PAM Site字段類型為“NGG”。這些字段下方的預(yù)覽顯示了該目標(biāo)和PAM序列的指導(dǎo)序列 - 即GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG

在本練習(xí)中，我們只關(guān)注“GN（20）GG”位點(diǎn)在序列中的位置，因此取消選中通過脫靶分析對位點(diǎn)進(jìn)行評分的選項(xiàng)。我們要評估每個(gè)位點(diǎn)的活動，因此請通過檢查目標(biāo)活動來保持分?jǐn)?shù)網(wǎng)站。對話框現(xiàn)在應(yīng)該如下圖所示。點(diǎn)擊確定運(yùn)行搜索。

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Geneious將使用“GN（20）GG”基序鑒定該序列上的任何CRISPR位點(diǎn)并對其進(jìn)行注釋。“查找CRISPR位點(diǎn)”功能每次運(yùn)行的注釋都被分組到一個(gè)標(biāo)有CRISPR位點(diǎn)的新軌道中。CDS中有41個(gè)“GN（20）GG”CRISPR位點(diǎn)。

將鼠標(biāo)懸停在其中一個(gè)網(wǎng)站上，您將看到一個(gè)彈出式窗口，其中包含有關(guān)該網(wǎng)站的信息。該信息包括On-target活動評分，其是在該位點(diǎn)的gRNA結(jié)合和Cas9切割效率的量度，如在Doench等2014中所計(jì)算的。此分?jǐn)?shù)是介于0和1之間的數(shù)字，數(shù)字越高表示預(yù)期活動越高。CRISPR位點(diǎn)注釋根據(jù)此分?jǐn)?shù)自動著色，從綠色（高分）到黃色和紅色（差分）的漸變。

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要從序列中刪除這些注釋，請單擊序列視圖中曲目名稱左側(cè)的箭頭，然后選擇刪除曲目。

未完，繼續(xù)第三[3]部分