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使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位點與脫靶結合位點[2]

基于機器學習翻譯,僅供參考

練習1:查找CRISPR位點

在本練習中,您將運行Find CRISPR位點功能來查找LYP1 CDS序列上的“GN(20)GG”CRISPR網站。

選擇LYP1 CDS(這個文件是geneious專用的demo數據格式,當您下載了geneious可以導入進去使用,或者導入您感興趣領域的數據)文檔,然后轉到克隆→查找CRISPR位點

首先,將選項重置為默認設置。要做到這一點,點擊窗口左下角的齒輪,并選擇重置為默認值(如果當前設置為默認設置,這將變為灰色)。

由于我們想要在此序列中的任意位置查找CRISPR位點,因此在綁定位點旁依次選擇無處不在

在Motif面板中,使用TargetPAM字段指定要搜索的gRNA序列。如果您希望評估所有潛在的CRISPR位點,請在目標框中輸入N(20)。或者,如果您想要檢查異地綁定的特定序列,則可以在目標框中輸入確切的序列。在本教程中,我們對“GN(20)GG”指南序列感興趣。目標序列為GN(19),PAM序列為NGG,因此目標字段類型為“GN(19)”,PAM Site字段類型為“NGG”。這些字段下方的預覽顯示了該目標和PAM序列的指導序列 - 即GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG

在本練習中,我們只關注“GN(20)GG”位點在序列中的位置,因此取消選中通過脫靶分析位點進行評分的選項我們要評估每個位點的活動,因此請通過檢查目標活動來保持分數網站對話框現在應該如下圖所示。點擊確定運行搜索。

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Geneious將使用“GN(20)GG”基序鑒定該序列上的任何CRISPR位點并對其進行注釋。“查找CRISPR位點”功能每次運行的注釋都被分組到一個標有CRISPR位點的新軌道中CDS中有41個“GN(20)GG”CRISPR位點。

將鼠標懸停在其中一個網站上,您將看到一個彈出式窗口,其中包含有關該網站的信息。該信息包括On-target活動評分,其是在該位點的gRNA結合和Cas9切割效率的量度,如在Doench等2014中所計算的此分數是介于0和1之間的數字,數字越高表示預期活動越高。CRISPR位點注釋根據此分數自動著色,從綠色(高分)到黃色和紅色(差分)的漸變。


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要從序列中刪除這些注釋,請單擊序列視圖中曲目名稱左側的箭頭,然后選擇刪除曲目


未完,繼續第三[3]部分

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