練習3：查找CRISPR位點并檢查脫靶匹配

在之前的練習中，您對LYP1基因上的所有“GN（20）GG”位點進行了與啤酒糖酵母基因組的脫靶結合的評分?。由于釀酒酵母基因組相對較小并且LYP1基因上僅有少量“GN（20）GG”位點，因此該搜索相對較快。但是，如果您正在測試針對較大基因組（例如，人類基因組）的脫靶結合和/或對較大數量的CRISPR位點進行評分，則此搜索可能需要很長時間。在本練習中，我們將使用Find CRISPR位點工具中的其中一種替代搜索策略來丟棄一些網站并加快搜索速度。

選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數據，可以下載）并轉到克隆→查找CRISPR位點。

如前面的練習中，在Binding位點旁邊依次選擇Anywhere。在目標類型“GN（19）”?旁邊的字段以及PAM Site字段中鍵入“NGG”。

在本練習中，我們希望使用其中一種替代搜索策略來丟棄具有強大異地匹配的CRISPR位點，因此在“?速度和過濾器”策略下選擇“?快速” - 丟棄更多位點。脫靶數據庫仍應設置為酵母基因組文件夾。

對話框現在應該如下圖所示。點擊確定運行搜索。

使用這種搜索策略，Geneious僅在該序列中注釋了五個CRISPR位點。

在搜索結果中，任何發現與PAM位點中沒有不匹配或在PAM位點旁邊的前8bp內發現有脫靶匹配的位點都將從搜索中刪除。Geneious沒有為這些位點尋找進一步的非目標匹配，CRISPR位點也沒有在序列中注釋。

要從序列中刪除這些注釋，請單擊序列視圖中條目名稱左側的箭頭，然后選擇刪除條目。

未完，繼續[5]